Centre de recherche en cancérologie - Lyon

Les programmes de recherche in vitro visent à disséquer les modalités d'interaction entre HBV et les récepteurs de type Toll (TLR), ainsi que les voies de signalisation associées, de manière là aussi à renforcer l'immunité innée hépatique dans une perspective thérapeutique. Enfin, de nouvelles approches antivirales sont aussi évaluées sur des virus sauvages et mutants répliquant dans des lignées hépatocytaires. L’évaluation de nouvelles molécules et autres stratégies thérapeutiques (par exemple vaccin thérapeutique) des hépatites B chroniques est effectuée en pre-clinique grâce aux différents modèles cellulaires et surtout aux modèles animaux originaux développés au laboratoire (canard de Pékin infecté par DHBV et Marmotte Américaine infectée par WHV). L'infection par HCV est, comme pour HBV, un facteur de risque important pour le développement du CHC. L'infection par ce virus modifie les caractéristiques du métabolisme glucidique et lipidique du foie, probablement afin de conférer aux virions HCV des propriétés protéiques et lipidiques particulières qui favoriseraient la persistance. Dans ce contexte, notre but est de mieux comprendre ces modifications au niveau cellulaire et de la particule infectieuse dans des modèles expérimentaux et à travers des études de recherche clinique. La modulation ciblée de facteurs ou de voies cellulaires que nous identifierons comme nécessaires voire bénéfiques à la production d’HCV par l'hépatocyte nous permettra de caractériser de nouvelles cibles moléculaires, mais aussi de nouveaux systèmes d'infection in vitro et in vivo pour ce virus. De tels systèmes seront en effet cruciaux pour comprendre de manière plus approfondie la pathogenèse de cette infection par HCV et son rôle dans le développement du CHC. Des études translationnelles, de cohortes de patients, et autres essais thérapeutiques, sur les thèmes précédemment cités, sont également conduits en relation avec le service d’Hépato-Gastroentérologie de la Croix Rousse des Hospices Civils de Lyon (HCL) dans le cadre d’un centre de recherche clinique (CRC) récemment labellisé. Figures présentant la problématique et les axes principaux de recherche de l’équipe

“HepaCute: Host and viral factors in acute hepatitis C” (FP7 consortium) 

Despite the high chronicity rate, 70-80% of acute hepatitis C cases are mild or asymptomatic and frequently undiagnosed. Once chronic infection is established antiviral treatment is effective in 40-50% of patients. In contrast, early treatment with interferon-alpha during the acute phase of infection can resolve infection in 95% of cases. Thus, treating HCV infected patients during the acute phase of infection provides a unique opportunity to prevent new cases of chronic hepatitis C. Furthermore, early interferon-alpha treatment can be avoided in the 40-50% of symptomatic patients who resolve infection spontaneously, obviating the need to treat patients with an expensive drug (ca. 20,000 €/yr) that has a frequently adverse effects. The HepaCute consortium, in collaboration with Egypt, where HCV prevalence rates of 20% lead to incidence rates of 6.8 per 1,000 person years, aims to increase acute hepatitis C detection rates in order to prevent new chronic hepatitis C cases. Furthermore is the consortium screening for biomarkers that predict viral clearance would provide optimal patient management and ensure appropriate targeting of drugs to the patient population most likely to benefit.

Pendant de nombreuses années, le virus de l’hépatite B (HBV) a été considéré comme un virus invisible qui n’induisait pas de réponse interféron au cours de la phase aigue de l’infection contrairement aux virus HIV ou HCV. Notre laboratoire a montré qu’HBV était capable d’induire une réponse interféron dans un cadre expérimental de réplication forte et synchronisée (Lucifora et al., Hepatology 2010). Dans le cas d’une infection persistante, le virus est capable d’inhiber la réponse immunitaire naissante au niveau de la cellule infectée mais également de manière systémique. Ainsi le virus est capable d’installer une véritable immuno-tolérance à son égard qui contribue à la persistance virale. Au laboratoire nous nous intéressons notamment à la phase précoce de l’infection car elle devrait nous permettre de déterminer quels sont les senseurs de l’immunité innée (PRR ; pathogen recognition receptors) impliqués dans la détection précoce du virus, les PAMPs (pathogen associated molecular patterns) responsable de la détection, et les voies de signalisation activées puis inhibées par le virus. L’inhibition très rapide au niveau de la cellule infectée et au niveau systémique implique qu’une ou plusieurs protéines virales va jouer un rôle très actif et efficace, et il nous faut comprendre les mécanismes moléculaires de cette inhibition afin de pouvoir la débloquer dans une stratégie thérapeutique. L’identification des voies de signalisation qui ne sont ni impliquées dans la détection du virus, ni ciblées par le virus, est également un objectif, car cela pourrait permettre de développer des agonistes activant ces voies qui pourraient permettre de rompre l’immuno-tolérance induite par le virus en phase chronique. Une autre stratégie afin de rompre l’immuno-tolérance est de développer des vaccins thérapeutiques, basées sur l’injection d’ADN nu et de virus recombinant. Le laboratoire a une longue expérience dans la recherche et le développement d’un tel vaccin notamment en utilisant le modèle d’infection chronique du canard de Pékin par le DHBV (Rollier et al., Gastroenterology, 1999). L’équipe a évalué dans ce modèle l’efficacité de différentes combinaisons thérapeutiques associant des antiviraux avec des plasmides exprimant les protéines structurales virales et des vecteurs exprimant les cytokines (IL-2, IFN-gamma). Plus récemment une collaboration avec le groupe pharmaceutique Transgene est venue redynamiser cet effort de R&D et devrait se traduire à termes par des essais cliniques chez l’homme. Afin de combiner le plus efficacement possible les éléments immuno-thérapeutiques avec les analogues de nucléos(t)ides (AN) qui sont utilisés à l’heure actuelle dans le traitement des hépatites B, il convient de déterminer comment la combinaison pourra être la plus efficace. Ainsi des études sur des cohortes de patients visent à déterminer si l’inhibition par les AN peut permettre de modifier l’équilibre qu’il existe entre réplication et inhibition des réponses immunitaires. Enfin le laboratoire continue son effort de R&D de petites molécules à effet antiviral direct (ex : nouveaux analogues de nucleos(t)ides, anti-capsides, et molécules antisens (PNA)) ou indirect (agonistes des TLRs, molécules ciblant les modifications épigénétiques, et autres immunomodulateurs) pour compléter l’arsenal thérapeutique existant. Là encore les modèles cellulaires et animaux développés au laboratoire sont particulièrement intéressant pour les phases pré-cliniques de développement. Figure présentant les axes de recherche concernant le développement de nouvelles approches thérapeutiques

La gravité de l’hépatite C provient de la très grande fréquence des infections chroniques qui peuvent évoluer vers la cirrhose et le cancer du foie. Malgré l’importance des connaissances accumulées depuis la caractérisation moléculaire du VHC en 1989 concernant les protéines virales et leur implication dans le cycle de réplication virale, environ un patient sur 2 dans le cadre d’infections à génotype 1, le plus fréquent en Europe, ne répond pas au traitement antiviral. L’identification de nouvelles modalités d’interaction du virus avec sa cellule cible, l’hépatocyte est donc perçue comme nécessaire à l’amélioration des chances de succès thérapeutique dans ce contexte. La recherche dans le domaine de l’hépatite C tend donc actuellement à considérer davantage les caractéristiques de l’hôte dans l’issue du traitement. Comme chez de nombreuses espèces virales, les virions du VHC s’associent à divers constituants cellulaires issus de l’hôte dans le but de tirer avantage de leur présence en termes de, morphogenèse, sécrétion, stabilité, capacité à réinfecter la cellule cible avec le matériel d’origine cellulaire nécessaire à sa réinfection, et capacité à dissimuler sa présence au système immunitaire. A priori donc, les protéines de l’hôte associées aux particules virales du VHC (PHAV) sont des candidats de choix pour identifier des partenaires cellulaires indispensables au cycle viral et potentiellement impliquées dans la non-réponse thérapeutique du patient. Une première phase de ce programme de recherche, qui s’est déroulée sur des particules purifiées du VHC produites in vitro, a été mené à bien et a permis l’identification de diverses PHAV (n = 46) dont certaines indispensables à la sécrétion virale ((Parent et al. Hepatology. 2009; figure ci-dessus), et données non publiées). La seconde phase de ce projet a pour but d’augmenter autant que possible la pertinence physiopathologique de cette étude en mettant en œuvre la purification de particules du VHC d’origine clinique (par le recrutement de 15 à 20 patients non répondeurs ainsi que de 3 à 5 patients répondeurs en tant que contrôles) et l’identification par spectrométrie de masse des PHAV associées à ces particules. La comparaison des PHAV d’origine plasmatique et des PHAV identifiées précédemment dans des systèmes de culture in vitro du VHC permettra le développement de programmes de recherche sur des cibles de pertinence physiopathologique maximale mais aussi dont l’implication dans le cycle viral pourra être étudiée sur un plan mécanistique in vitro. Nous espérons, par cette étude, contribuer à l’identification de nouveaux partenaires d’interaction viraux et cellulaires, potentiellement valorisables sur le plan thérapeutique.

Axe 2 : Nétrine et virus de l'hépatite C (Coll. Equipes P. Mehlen et F. Zoulim du CRCL)
L’infection par le VHC provoque une augmentation des transcrits de nétrine-1. Des cellules Huh7.5 ont été infectées par le VHC (souche JFH1 comportant trois mutations adaptatives) pendant 10j et fait l’objet de quantification du transcrit de la nétrine-1 par PCR quantitative. Le concept de récepteur à dépendance (RD) représente une des avancées les plus novatrices des dix dernières années en biologie cellulaire et du développement. Cette voie impliquée dans la survie cellulaire est actrice dans plusieurs fonctions en physiologie et pathologie humaine. Un ensemble de résultats préliminaires obtenus dans notre groupe suggère une interaction entre la voie canonique des RDs, la voie nétrine-1 / uncoordinated phenotype 5A (NTN1 / UNC5A) et le virus de l’hépatite C (VHC) : l’augmentation des transcrits de la NTN1 et de son récepteur UNC5A dans des cellules infectées par le VHC (Figure X ci-dessus), une colocalisation massive entre la glycoproteine d’enveloppe E2 du VHC et UNC5A dans ces cellules, ainsi que la modulation positive de UNC5A et négative de la NTN1 par l’interféron alpha. Ces résultats ont été confirmés sur les souches H77 et N de génotype 1. La fonctionnalité de la voie NTN1 / UNC5A a été démontrée dans les cellules Huh7.5 par des tests de croissance cellulaire. Orientés par ces résultats, les objectifs de ce projet sont l’étude de l’interaction entre la voie canonique des récepteurs à dépendance et le virus de l’hépatite C, à travers différentes approches :
1 – Développement d’anticorps polyclonaux contre la NTN1 et UNC5A, confirmation de la modulation viro-induite de la NTN1 et de son récepteur UNC5A au niveau protéique
2 – Identification des protéines virales et de leurs déterminants structuraux ainsi que des étapes fonctionnelles du cycle viral à l’origine de l’induction de la NTN1 et de UNC5A,
3 – Etude des conséquences de cette altération de la voie NTN1 / UNC5A par le VHC sur :
- sa propre réplication à travers plusieurs paramètres (réplication intracellulaire, niveau de sécrétion de l’ARN viral dans le surnageant, et infectiosité spécifique),
- le phénotype cellulaire (différenciation hépatocytaire, susceptibilité à l’apoptose),
4 – Etude du rôle potentiel de la NTN1 et UNC5A dans l’immunité innée hépatocytaire.


Le monde biologique selon Wassily Kandinsky (Composition IX, Paris, 1936)

Dans ce contexte, une meilleure compréhension des cycles d'infection et des étapes précoces de l'oncogenèse virale permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans un premier axe de recherche centré sur HCV, nous étudierons le micro-environnement hépatique au cours de l'infection, et les altérations qu'il subit sous l'influence du stress oxydant généré par la réplication virale. Ces résultats fondamentaux seront mis à profit dans un second axe de recherche pour proposer de nouvelles pistes thérapeutiques, notamment contre HBV et HDV.

Pemier Axe

Dans le foie, HCV n'infecte de façon productive que l'hépatocyte (1), alors que l’espace de Disse où se situent ces cellules contient également les cellules étoilées, des macrophages (ou cellules de Küpffer) et les cellules endothéliales bordant les capillaires sinusoïdes (cf Figure). Partant de cette constatation, nous avons fait l'hypothèse qu'une même molécule, présente à proximité de ou à la surface de l'hépatocyte, pourrait jouer à la fois un rôle dans le déclenchement de l'infection (au stade de l'entrée du virus dans l'hépatocyte) et dans le processus de carcinogenèse. Nous avons concentré nos efforts sur une molécule de la famille des héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG), le syndecan-1, présente dans le micro-environnement hépatocytaire ou glycocalyx, car : (i) c'est une glycoprotéine transmembranaire capable de transduire du signal et récepteur de lipoprotéines, qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme lipidique du foie, détourné et perturbé par le virus; (ii) elle joue un rôle pivot via ses contacts avec des protéines de l'adhésion et de la communication cellulaire, et enfin (iii) c'est un marqueur tumoral de certaines leucémies.

Nos résultats récents démontrent l'implication du syndecan-1 dans l'infection par HCV, au stade précoce de la pénétration du virus dans l'hépatocyte mais également à des stades plus tardifs où le virus se réplique en association avec des compartiments membranaires intracellulaires (2-4). Ceci se fait en étroite coopération structurale et fonctionnelle avec CD81, le premier récepteur de HCV découvert. Dès les premiers jours de l'infection, l'expression et la localisation subcellulaire du syndecan-1 dans les cellules infectées sont modifiées par rapport aux cellules non infectées. En parallèle, la composition du glycocalyx est altérée, du fait de perturbations de l’activité d’enzymes-clé de biosynthèse et métabolisme des HSPG. L'infection par HCV conduit aussi à : (i) une accumulation des métabolites intermédiaires de la glycolyse, déclenchant un stress oxydant intracellulaire (5), (ii) une surexpression de certaines métalloprotéinases, remodelant le micro-environnement et la matrice extracellulaire (MEC) hépatiques, et (iii) une altération de l’expression et de la localisation subcellulaire de protéines des jonctions cellulaires telles que la E-cadhérine. Ceci laisse supposer une étroite intrication entre infection, altérations du profil de glycosylation des protéines (en particulier des HSPG du glycocalyx), et dérégulation des communications cellule/cellule et cellule/MEC, signature précoce de la carcinogenèse.

A partir de ces observations, notre projet se déroule en 3 actes :

- identifier les voies géniques syndecan-1 dépendantes, dérégulées au cours de l'infection, par approches transcriptomiques et CRISPR-Cas9 ;

- étudier de façon approfondie comment HCV remodèle le micro-environnement hépatocytaire, au sens étroit (glycocalyx) et large du terme (espace de Disse) ;

- disséquer le lien entre stress oxydant, altérations du micro-environnement et infection par HCV, en étudiant spécifiquement des enzymes et protéines-clé impliquées dans ou responsables de ces phénomènes (héparanases, matrix-métalloprotéinases, superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, syndecan-1, glypican-3...), en cultures cellulaires et sur biopsies de patients infectés.

Second Axe

La compréhension des mécanismes fondamentaux de l'infection virale permet des avancées sur le front de stratégies antivirales adaptées au traitement d'une maladie chronique, évoluant par paliers (infection aiguë, fibrose, cirrhose, CHC). Depuis plusieurs mois, nous explorons les possibilités antivirales de deux molécules déjà administrées en médecine humaine pour d'autres indications : l'arbidol et la silibinine. Nous avons démontré leur activité inhibitrice de l'entrée de HCV dans l'hépatocyte (6-9), et d'autres étapes du cycle viral comme la réplication et l'assemblage des virions néo-formés (10). L’arbidol a également une activité anti-HBV (11).

Ces deux molécules agissent directement sur le virus et aussi sur des cibles cellulaires, faisant d'elles des antiviraux à large spectre et des agents ciblant l'hôte. Elles revêtent donc un double intérêt thérapeutique : elles sont utilisables en phase d'infection aiguë (inhibition de l'entrée virale; 8, 12) et chronique. Nos résultats récents indiquent d’une part que la silibinine inhibe l'entrée de HBV et HDV dans l'hépatocyte, et d’autre part qu’elle induit une sous-régulation de l’expression des HSPG. Les HSPG étant des facteurs d’attachement et d’entrée de HBV et HDV (13,14), ce phénomène de sous-régulation pourrait ainsi contribuer à expliquer le mécanisme d’action antivirale de la silibinine.

Le potentiel antiviral de ces molécules, éventuellement effectif à des étapes précoces de l'oncogenèse viro-induite, sera donc exploré de façon approfondie, en visant à la plus grande pertinence physio-pathologique. En effet, ce potentiel sera évalué dans l'infection d'hépatocytes primaires humains par des virions sériques issus de patients infectés, et chez l'animal. La silibinine a de plus démontré un effet anti tumoral in cellulo; nous étudierons ainsi son potentiel sur des cellules d'hépatocarcinome viro-induit (HBV ou HCV) ou non, et chez l’animal infecté.

Références

1 - Perrault M, Pécheur EI. Biochem J. 2009 Nov;423:303-314. Invited Review.

2 - http://viewer.zmags.com/publication/03efcb6d#/03efcb6d/34 : poster highlight, EASL 2014 - International Liver Congress (London, 9-13 april 2014).

3 - Grigorov B, Gentil dit Maurin A, Varbanov M, Blaising J, Michelet M, Ruggiero F, Pécheur EI. P199. J Hepatol. 2014;60(1) Supplement S132.

4 - Grigorov B, Reungoat E *, Gentil dit Maurin A *, Varbanov M *, Blaising J, Michelet M, Manuel R, Parent R, Bartosch B, Zoulim F, Ruggiero F, Pécheur EI. Submitted.

5 - Brault C, Lévy P, Duponchel S, Michelet M, Sallé A, Pécheur EI, Plissonnier ML, Parent R, Véricel E, Ivanov AV, Demir M, Steffen HM, Odenthal M, Zoulim F, Bartosch B. Gut. 2016 Jan;65(1):144-154.

6 - Blaising J, Lévy PL, Gondeau C, Phelip C, Varbanov M, Teissier E, Ruggiero F, Polyak SJ, Oberlies NH, Ivanovic T, Boulant S, Pécheur EI. Cell Microbiol. 2013 Nov;15(11):1866-82.

7 - Blaising J *, Lévy PL *, Polyak SJ, Stanifer M, Boulant S, Pécheur EI. Antiviral Res. 2013 Oct;100(1):215-9.

8 - Blaising J, Polyak SJ, Pécheur EI. Antiviral Res. 2014 Jul;107C:84-94. Invited Review.

9 - Teissier E, Zandomeneghi G, Loquet A, Lavillette D, Lavergne JP, Montserret R, Cosset FL, Böckmann A, Meier BH, Penin F, Pécheur EI. PLoS One. 2011 Jan 25;6(1):e15874.

10 - Wagoner J, Negash A, Kane OJ, Martinez LE, Nahmias Y, Bourne N, Owen DM, Grove J, Brimacombe C, McKeating JA, Pécheur EI, Graf TN, Oberlies NH, Lohmann V, Cao F, Tavis JE, Polyak SJ. Hepatology. 2010 Jun;51(6):1912-21.

11 - Pécheur EI, Borisevich V, Halfmann P, Morrey JD, Smee DF, Prichard M, Mire CE, Kawaoka Y, Geisbert TW, Polyak SJ. J Virol. In revision.

12 - Pécheur EI. Gut. 2014 Jul;63(7):1035-7. Invited Editorial.

13 - Schulze A, Gripon P, Urban S. Hepatology. 2007 Dec;46(6):1759-68.

14 - Lamas Longarela O, Schmidt TT, Schöneweis K, Romeo R, Wedemeyer H, Urban S, Schulze A. PLoS One. 2013;8(3):e58340.

Ideas are like fish. If you want to catch little fish, you can stay in the shallow water. But if you want to catch the big fish, you’ve got to go deeper.

David Lynch.

Nos principales réalisations de bases de données et de serveurs sont :
- BCL2DB : database of BCL-2 family members and BH3-only proteins
- BYKdb : the Bacterial protein tYrosine Kinase database
- euHCVdb : the European hepatitis C virus database
- Geno3D : An automated protein modeling Web server
- HBVdb : a knowledge database for Hepatitis B Virus
- NPS@ : Network Protein Sequence Analysis

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