Centre de recherche en cancérologie - Lyon

Les virus des hépatites B et C sont responsables d’infections chroniques chez près de 600 millions de personnes dans le monde et favorisent le développement d’atteinte hépatique (stéatose et fibrose) pouvant conduire à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire (CHC). Les objectifs principaux de l’équipe sont de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent l’établissement et le maintien des infections persistantes par les virus des hépatites B et C. Une meilleure compréhension de ces mécanismes devrait permettre le développement de nouvelles stratégies antivirales (directe ou par stimulation du système immunitaire) visant à l’éradication des infections virales et la prévention (CHC) ou la régression (stéatose, fibrose) des pathologies associées.

Hépatites B et C : pathogenèse et nouveaux traitements
Pour développer de nouvelles stratégies de prévention du CHC induit par HBV, il est indispensable de comprendre qu’elles sont pour ce virus les possibilités d'échappement initial et chronique à la pression immune et antivirale, induisant une tolérance immune et la persistance virale. L'étude des interactions virus-cellules et la caractérisation de la réponse immunitaire innée de l'hépatocyte à HBV devraient en effet contribuer à identifier les mécanismes impliqués dans la persistance virale et la transformation cellulaire. Par ailleurs, de nouvelles stratégies d'immunisation de patients infectés chroniquement par HBV et sous antiviraux sont aussi évaluées avec pour objectif d'augmenter les réponses T spécifiques.

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Les programmes de recherche in vitro visent à disséquer les modalités d'interaction entre HBV et les récepteurs de type Toll (TLR), ainsi que les voies de signalisation associées, de manière là aussi à renforcer l'immunité innée hépatique dans une perspective thérapeutique. Enfin, de nouvelles approches antivirales sont aussi évaluées sur des virus sauvages et mutants répliquant dans des lignées hépatocytaires. L’évaluation de nouvelles molécules et autres stratégies thérapeutiques (par exemple vaccin thérapeutique) des hépatites B chroniques est effectuée en pre-clinique grâce aux différents modèles cellulaires et surtout aux modèles animaux originaux développés au laboratoire (canard de Pékin infecté par DHBV et Marmotte Américaine infectée par WHV). L'infection par HCV est, comme pour HBV, un facteur de risque important pour le développement du CHC. L'infection par ce virus modifie les caractéristiques du métabolisme glucidique et lipidique du foie, probablement afin de conférer aux virions HCV des propriétés protéiques et lipidiques particulières qui favoriseraient la persistance. Dans ce contexte, notre but est de mieux comprendre ces modifications au niveau cellulaire et de la particule infectieuse dans des modèles expérimentaux et à travers des études de recherche clinique. La modulation ciblée de facteurs ou de voies cellulaires que nous identifierons comme nécessaires voire bénéfiques à la production d’HCV par l'hépatocyte nous permettra de caractériser de nouvelles cibles moléculaires, mais aussi de nouveaux systèmes d'infection in vitro et in vivo pour ce virus. De tels systèmes seront en effet cruciaux pour comprendre de manière plus approfondie la pathogenèse de cette infection par HCV et son rôle dans le développement du CHC. Des études translationnelles, de cohortes de patients, et autres essais thérapeutiques, sur les thèmes précédemment cités, sont également conduits en relation avec le service d’Hépato-Gastroentérologie de la Croix Rousse des Hospices Civils de Lyon (HCL) dans le cadre d’un centre de recherche clinique (CRC) récemment labellisé. Figures présentant la problématique et les axes principaux de recherche de l’équipe

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Biology of cccDNA and novel biomarkers for in chronic HBV infections

Context: The goals of current HBV therapy are to prevent the development of cirrhosis, hepatic decompensation, hepatocellular carcinoma (HCC) and death from HBV-related liver disease, which represents the 3^rd mortality cause worldwide. This, associated to suboptimal vaccination coverage in highly endemic areas, make CHB a worldwide major health burden, with more than 240 million people being chronic carriers of the infection.

Current first-choice treatments for chronic hepatitis B (CHB) are able to efficiently induce viral suppression in the majority of patients, but life-long therapy is needed to maintain infection under control due to their inability to eliminate the virus from infected hepatocytes. Indeed, the hepatitis B virus (HBV) minichromosome, the so-called covalently closed circular (ccc)DNA, is wrapped around nucleosomes to form a stable, chromatinized structure that is regulated by epigenetic mechanisms and is responsible for viral persistence in the nucleus of infected cells. Moreover, the ability of HBV to integrate into the host genome hampers a complete sterilizing cure.

The residual viral replication and antigen production in most patients under treatment substantially contributes to the residual risk of hepatocarcinogenesis.

New therapeutic approaches are needed to overcome HBV persistence in the infected cells, or at least, to control its transcriptional and replicative activity.

Concomitantly, the advent of new combinatorial therapies requires the need of defining new endpoints for the assessment of therapeutic efficiency and of serum standardized assays representing surrogate markers intrahepatic viral activity.

Objectives:

1°) Generate new knowledge on cccDNA biology, in particular on the key steps leading to its formation and to its transcriptional regulation once the pool is established, in vitro and in vivo

2°) Investigate Gene editing approaches to induce cccDNA degradation

3°) Investigate new serum surrogate markers for intrahepatic cccDNA amount and/or activity; assess their correlation with intrahepatic HBV activity and evaluate their prognostic value in CHB patients cohorts

4°) Investigate the impact of viral/host genome genetic variability on cccDNA epigenetic regulation and on new antiviral treatments efficiency

5°) Analyze HBV integration in the host genome and its role in liver pathogenesis

Tumor cell-like metabolic adaptations in the pathophysiology of chronic viral hepatitis

Chronic infection with hepatitis B and C and D viruses (HBV/ HCV/HDV) is one of the main etiologies of hepatocellular carcinoma (HCC), the most common form of liver cancer. A major feature of chronic viral hepatitis is the frequent occurrence of oxidative stress and metabolic alterations, which play a major role in liver fibrosis and disease progression towards liver cancer.  At the interface between virology, cell biology and biochemistry, our laboratory is analyzing metabolic alterations and associated intracellular oxidative stress induced by hepatitis viruses and their respective roles in the development of liver fibrosis. We have found for example evidence for the installation of a tumor cell-like metabolism in HCV-infected cells, characterized by a special dependence on glutamine utilization. Importantly, altered glutamine fluxes impact mitochondria and mitochondrial functions and may alter cellular resistance to apoptosis, inflammatory processes, metabolic and redox homeostasis in infected cells and is thus potentially strongly pro-carcinogenic.

Our particular aims are:

·      To  show how hepatitis viruses modulate metabolic fluxes using biochemistry, molecular biology and metabolomics

·      To investigate how hepatitis viruses impact and alter mitochondrial structure and functions, via direct binding to these organelles or by altered function of mitochondrial or metabolic enzymes

·      Investigate how hepatitis virus-induced metabolic changes are linked to increased oxidative stress frequently observed in infection in vitro and in patients

·      To investigate how the above events drive fibrosis progression and hepatocarcinogenesis in infected patients

To find answers to these questions, we use a mixture of molecular and cellular biology, biochemistry, metabolomics, imaging and state of the art infection assays (P3 biosafety level). In addition, we have access to clinical cohorts and samples.

These studies will on the long term lead to the development of biomarkers and optimization of treatment modalities for fibrosis progression and prevention of hepatocarcinogenesis in viral hepatitis.

Selected publications from 2015-2017:

·      AV Ivanov, O Khomich, B Bartosch. Oxidative Stress in Hepatitis C infection; Bookchapter in  Liver Oxidative Stress and Dietary Antioxidants, edited by Vinood Patel. Elsevier. In press

·      O. Smirnova, T. Keinanen, O. Ivanova M. Hyvonen, A. Khomutov, S. Kochetkov, B. Bartosch, and A. Ivanov  Hepatitis C virus Alters metabolism of biogenic polyamines by affecting expression of key enzymes of their metabolism 2017 BBRC

·      AV Ivanov, VT Valuev-Elliston, DA Tyurina, ON Ivanova, SN Kochetkov, B Bartosch, MG Isaguliants Oxidative stress, a trigger of hepatitis C and B virus-induced liver carcinogenesis. 2017 Oncotarget

·      P.L. Lévy, S. Duponchel, H. Eischeid, M. Michelet, J. Molle, HP. Dienes, HM. Steffen, M. Odenthal, F. Zoulim, B. Bartosch. Hepatitis C virus infection triggers a tumor-like glutamine metabolism. 2017 Hepatology

·      A V. Ivanov, V T. Valuev-Elliston, O Ivanova, S N. Kochetkov, B Bartosch and M G. Isaguliants. Oxidative stress during HIV infection: mechanisms and consequences. 2016 Oxid Med Cell Longev

·      J  Rieusset ,  J  Fauconnier,  M  Paillard ,  E  Belaidi ,  E  Tubbs ,   M-A  Chauvin,  A  Durand ,  A  Bravard ,  G  Teixeira ,  B  Bartosch ,  M Michelet, P Theurey , G Vial , M Demion, E Blond , F Zoulim , L Gomez , H Vidal , A Lacampagne, M Ovize.  Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes (MAM) integrity to hepatic insulin resistance. 2016 Diabetologia

·      Charlène Brault, Pierre Lévy, Sarah Duponchel, Maud Michelet, Aurèlie Sallé, Eve-Isabelle Pecheur, Marie-Laure Plissonnier, Romain Parent, Evelyne Véricel, Alexander V Ivanov, Münevver Demir, Hans-Michael Steffen, Margarete Odenthal, Fabien Zoulim, Birke Bartosch. Glutathione peroxidase 4 is reversibly induced by HCV to control lipid peroxidation and to increase virion infectivity. 2016 Gut

·      Pierre Lévy, Birke Bartosch, Metabolic reprogramming: a hallmark of viral oncogenesis. 2015 Oncogene

·      Bartosch B. Piecing together the key players of fibrosis in chronic hepatitis C: what roles do non-hepatic liver resident cell types play? 2015 Gut

Nétrine-1, récepteurs UNC5 et maladies chroniques du foie

 Netrin-1 est une molécule sécrétée impliquée dans le développement neuronal. Il a également été démontré qu’elle était impliquée dans la pathogenèse et la résistance au traitement d'une gamme importante de types de cancer.

Cependant, aucune étude n'a abordé le rôle de la netrine-1 dans le domaine du foie. Nous avons déjà mis en œuvre plusieurs études visant à définir le rôle de l'axe netrin-1 / UNC5A dans la maladie chronique du foie, en utilisant les modèles HCV et UPR.

Nous avons montré que:

- Netrin-1 et HCV sont des inducteurs réciproques in vitro et chez les patients, par l'augmentation de la morphogenèse virale et de l'entrée virale, les deux phénomènes convergeant vers une augmentation du taux d'infectiosité des virions du VHC, de manière dépendante de l'EGFR. Cette association fonctionnelle impliquant un virus lié au cancer et la netrine-1 plaide en faveur de l’évaluation de l'implication des ligands de récepteurs UNC5 par d'autres espèces microbiennes oncogènes.

- Le récepteur à dépendance UNC5A contrecarre la persistance du VHC par la régulation de l'autophagie d'une manière dépendant de DAPK1 et diminue considérablement dans les échantillons de HCC, et plus particulièrement chez des cirrhotiques VHC+.

- Contrairement à plusieurs transcrits oncogènes structurellement apparentés (l-myc, c-myc, c-myb), l'ARN messager netrin-1 a été sélectionné pour la traduction pendant l'UPR à la fois dans les hépatocytes humains et chez les foies de souris. L'appauvrissement de la netrine-1 lors de l'UPR induit l'apoptose, entraînant la mort cellulaire par une intervention médiée par les récepteurs UNC5, la protéine phosphatase 2A et la DAPK1 associée à la mort in vitro et chez les souris transgéniques de la netrine. La traduction de la netrine-1 par sequence IRES conduit à l'inhibition de l'apoptose médiée par UNC5A / DAPK1 dans le contexte hépatique lors de l’UPR, une caractéristique de la maladie chronique du foie.

Les objectifs à aborder concernent:

- L'implication de la netrine-1 dans l'inflammation du foie 

- L'implication de la netrine-1 dans l'apparition du HCC 

Étant donné que l’upregulation de la netrin-1 couvre un large éventail de maladies du foie (Plos Biol 2016), de tels programmes pourraient contribuer à l’enrichissement des perspectives thérapeutiques relatives au CHC.

Publications du groupe relatives à ce thème:

1: Plissonnier ML, Lahlali T, Raab M, Michelet M, Romero-López C, Rivoire M, Strebhardt K, Durantel D, Levrero M, Mehlen P, Zoulim F, Parent R. Reciprocal antagonism between the netrin-1 receptor uncoordinated-phenotype-5A (UNC5A) and the hepatitis C virus. Oncogene. 2017 Aug 7. doi: 10.1038/onc.2017.271. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 28783179.

2: Lahlali T, Plissonnier ML, Romero-López C, Michelet M, Ducarouge B, Berzal-Herranz A, Zoulim F, Mehlen P, Parent R. Netrin-1 Protects Hepatocytes Against Cell Death Through Sustained Translation During the Unfolded Protein Response. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2016 Jan 9;2(3):281-301.e9. doi: 10.1016/j.jcmgh.2015.12.011. eCollection 2016 May. PubMed PMID: 28174720; PubMed 

Central PMCID: PMC5042567.

3: Plissonnier ML, Lahlali T, Michelet M, Lebossé F, Cottarel J, Beer M, Neveu G, Durantel D, Bartosch B, Accardi R, Clément S, Paradisi A, Devouassoux-Shisheboran M, Einav S, Mehlen P, Zoulim F, Parent R. Epidermal Growth Factor Receptor-Dependent Mutual Amplification between Netrin-1 and the Hepatitis C Virus. PLoS Biol. 2016 Mar 31;14(3):e1002421. doi: 10.1371/journal.pbio.1002421.  eCollection 2016 Mar. PubMed PMID: 27031829; PubMed Central PMCID: PMC4816328.

Héparanes sulfates protéoglycanes du microenvironnement hépatocytaire dans l’infection et la carcinogenèse précoce induite par les virus hépatotropes B, C et delta.

Les hépatites virales chroniques sont à l'origine de 75% des cas de carcinome hépatocellulaire (CHC), le 2ième cancer le plus léthal après le cancer du poumon et le 5ième en terme d'incidence mondiale. Aucune thérapie n'est réellement efficace contre le CHC, la seule option restant la transplantation hépatique. Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte chroniquement 180 millions d'individus, et bien que des traitements antiviraux efficaces soient actuellement disponibles, certains patients restent difficiles à traiter et en grand risque de développer un CHC. Les hépatites B et delta affectent respectivement 350 et 20 millions de personnes. Dues aux virus de l'hépatite B (HBV) et delta (HDV), elles posent des problèmes de santé publique du fait de la diversité des génotypes viraux, leur dissémination rapide, la sévérité des dommages hépatiques, l'émergence de variants viraux résistants, le contrôle pharmacologique insuffisant avec les thérapies actuelles et l'accès variable à des traitements coûteux.

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Dans ce contexte, une meilleure compréhension des cycles d'infection et des étapes précoces de l'oncogenèse virale permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans un premier axe de recherche centré sur HCV, nous étudierons le micro-environnement hépatique au cours de l'infection, et les altérations qu'il subit sous l'influence du stress oxydant généré par la réplication virale. Ces résultats fondamentaux seront mis à profit dans un second axe de recherche pour proposer de nouvelles pistes thérapeutiques, notamment contre HBV et HDV.

Pemier Axe

Dans le foie, HCV n'infecte de façon productive que l'hépatocyte (1), alors que l’espace de Disse où se situent ces cellules contient également les cellules étoilées, des macrophages (ou cellules de Küpffer) et les cellules endothéliales bordant les capillaires sinusoïdes (cf Figure). Partant de cette constatation, nous avons fait l'hypothèse qu'une même molécule, présente à proximité de ou à la surface de l'hépatocyte, pourrait jouer à la fois un rôle dans le déclenchement de l'infection (au stade de l'entrée du virus dans l'hépatocyte) et dans le processus de carcinogenèse. Nous avons concentré nos efforts sur une molécule de la famille des héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG), le syndecan-1, présente dans le micro-environnement hépatocytaire ou glycocalyx, car : (i) c'est une glycoprotéine transmembranaire capable de transduire du signal et récepteur de lipoprotéines, qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme lipidique du foie, détourné et perturbé par le virus; (ii) elle joue un rôle pivot via ses contacts avec des protéines de l'adhésion et de la communication cellulaire, et enfin (iii) c'est un marqueur tumoral de certaines leucémies.

Nos résultats récents démontrent l'implication du syndecan-1 dans l'infection par HCV, au stade précoce de la pénétration du virus dans l'hépatocyte mais également à des stades plus tardifs où le virus se réplique en association avec des compartiments membranaires intracellulaires (2-4). Ceci se fait en étroite coopération structurale et fonctionnelle avec CD81, le premier récepteur de HCV découvert. Dès les premiers jours de l'infection, l'expression et la localisation subcellulaire du syndecan-1 dans les cellules infectées sont modifiées par rapport aux cellules non infectées. En parallèle, la composition du glycocalyx est altérée, du fait de perturbations de l’activité d’enzymes-clé de biosynthèse et métabolisme des HSPG. L'infection par HCV conduit aussi à : (i) une accumulation des métabolites intermédiaires de la glycolyse, déclenchant un stress oxydant intracellulaire (5), (ii) une surexpression de certaines métalloprotéinases, remodelant le micro-environnement et la matrice extracellulaire (MEC) hépatiques, et (iii) une altération de l’expression et de la localisation subcellulaire de protéines des jonctions cellulaires telles que la E-cadhérine. Ceci laisse supposer une étroite intrication entre infection, altérations du profil de glycosylation des protéines (en particulier des HSPG du glycocalyx), et dérégulation des communications cellule/cellule et cellule/MEC, signature précoce de la carcinogenèse.

A partir de ces observations, notre projet se déroule en 3 actes :

- identifier les voies géniques syndecan-1 dépendantes, dérégulées au cours de l'infection, par approches transcriptomiques et CRISPR-Cas9 ;

- étudier de façon approfondie comment HCV remodèle le micro-environnement hépatocytaire, au sens étroit (glycocalyx) et large du terme (espace de Disse) ;

- disséquer le lien entre stress oxydant, altérations du micro-environnement et infection par HCV, en étudiant spécifiquement des enzymes et protéines-clé impliquées dans ou responsables de ces phénomènes (héparanases, matrix-métalloprotéinases, superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, syndecan-1, glypican-3...), en cultures cellulaires et sur biopsies de patients infectés.

Second Axe

La compréhension des mécanismes fondamentaux de l'infection virale permet des avancées sur le front de stratégies antivirales adaptées au traitement d'une maladie chronique, évoluant par paliers (infection aiguë, fibrose, cirrhose, CHC). Depuis plusieurs mois, nous explorons les possibilités antivirales de deux molécules déjà administrées en médecine humaine pour d'autres indications : l'arbidol et la silibinine. Nous avons démontré leur activité inhibitrice de l'entrée de HCV dans l'hépatocyte (6-9), et d'autres étapes du cycle viral comme la réplication et l'assemblage des virions néo-formés (10). L’arbidol a également une activité anti-HBV (11).

Ces deux molécules agissent directement sur le virus et aussi sur des cibles cellulaires, faisant d'elles des antiviraux à large spectre et des agents ciblant l'hôte. Elles revêtent donc un double intérêt thérapeutique : elles sont utilisables en phase d'infection aiguë (inhibition de l'entrée virale; 8, 12) et chronique. Nos résultats récents indiquent d’une part que la silibinine inhibe l'entrée de HBV et HDV dans l'hépatocyte, et d’autre part qu’elle induit une sous-régulation de l’expression des HSPG. Les HSPG étant des facteurs d’attachement et d’entrée de HBV et HDV (13,14), ce phénomène de sous-régulation pourrait ainsi contribuer à expliquer le mécanisme d’action antivirale de la silibinine.

Le potentiel antiviral de ces molécules, éventuellement effectif à des étapes précoces de l'oncogenèse viro-induite, sera donc exploré de façon approfondie, en visant à la plus grande pertinence physio-pathologique. En effet, ce potentiel sera évalué dans l'infection d'hépatocytes primaires humains par des virions sériques issus de patients infectés, et chez l'animal. La silibinine a de plus démontré un effet anti tumoral in cellulo; nous étudierons ainsi son potentiel sur des cellules d'hépatocarcinome viro-induit (HBV ou HCV) ou non, et chez l’animal infecté.

Références

1 - Perrault M, Pécheur EI. Biochem J. 2009 Nov;423:303-314. Invited Review.

2 - http://viewer.zmags.com/publication/03efcb6d#/03efcb6d/34 : poster highlight, EASL 2014 - International Liver Congress (London, 9-13 april 2014).

3 - Grigorov B, Gentil dit Maurin A, Varbanov M, Blaising J, Michelet M, Ruggiero F, Pécheur EI. P199. J Hepatol. 2014;60(1) Supplement S132.

4 - Grigorov B, Reungoat E *, Gentil dit Maurin A *, Varbanov M *, Blaising J, Michelet M, Manuel R, Parent R, Bartosch B, Zoulim F, Ruggiero F, Pécheur EI. Submitted.

5 - Brault C, Lévy P, Duponchel S, Michelet M, Sallé A, Pécheur EI, Plissonnier ML, Parent R, Véricel E, Ivanov AV, Demir M, Steffen HM, Odenthal M, Zoulim F, Bartosch B. Gut. 2016 Jan;65(1):144-154.

6 - Blaising J, Lévy PL, Gondeau C, Phelip C, Varbanov M, Teissier E, Ruggiero F, Polyak SJ, Oberlies NH, Ivanovic T, Boulant S, Pécheur EI. Cell Microbiol. 2013 Nov;15(11):1866-82.

7 - Blaising J *, Lévy PL *, Polyak SJ, Stanifer M, Boulant S, Pécheur EI. Antiviral Res. 2013 Oct;100(1):215-9.

8 - Blaising J, Polyak SJ, Pécheur EI. Antiviral Res. 2014 Jul;107C:84-94. Invited Review.

9 - Teissier E, Zandomeneghi G, Loquet A, Lavillette D, Lavergne JP, Montserret R, Cosset FL, Böckmann A, Meier BH, Penin F, Pécheur EI. PLoS One. 2011 Jan 25;6(1):e15874.

10 - Wagoner J, Negash A, Kane OJ, Martinez LE, Nahmias Y, Bourne N, Owen DM, Grove J, Brimacombe C, McKeating JA, Pécheur EI, Graf TN, Oberlies NH, Lohmann V, Cao F, Tavis JE, Polyak SJ. Hepatology. 2010 Jun;51(6):1912-21.

11 - Pécheur EI, Borisevich V, Halfmann P, Morrey JD, Smee DF, Prichard M, Mire CE, Kawaoka Y, Geisbert TW, Polyak SJ. J Virol. In revision.

12 - Pécheur EI. Gut. 2014 Jul;63(7):1035-7. Invited Editorial.

13 - Schulze A, Gripon P, Urban S. Hepatology. 2007 Dec;46(6):1759-68.

14 - Lamas Longarela O, Schmidt TT, Schöneweis K, Romeo R, Wedemeyer H, Urban S, Schulze A. PLoS One. 2013;8(3):e58340.

Ideas are like fish. If you want to catch little fish, you can stay in the shallow water. But if you want to catch the big fish, you’ve got to go deeper.

David Lynch.